跪求實驗方案急。關於植物小分子多肽的提取分離和分析最好用到高效液相提取的

時間 2022-09-04 05:20:27

1樓:匿名使用者

高效液相色譜檢測法  高效液相色譜以經典的液相色譜為基礎,是以高壓下的液體為流動相的色譜過程。通常所說的柱層析、薄層層析或紙層析就是經典的液相色譜。所用的固定相為大於100um 的吸附劑( 矽膠、氧化鋁等)。

這種傳統的液相色譜所用的固定相粒度大,傳質擴散慢,因而柱效低,分離能力差,只能進行簡單混合物的分離。而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、傳質快、柱效高。

高效液相色譜法(hplc)是20世紀60年代後期發展起來的一種分析方法。近年來,在保健食品功效成分、營養強化劑、維生素類、蛋白質的分離測定等應用廣泛。世界上約有80%的有機化合物可以用hplc來分析測定。

編輯本段高效液相色譜分析原理(一)高效液相色譜分析的流程  由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統,然後輸出,經流量與壓力測量之後,匯入進樣器。被測物由進樣器注入,並隨流動相通過色譜柱,在柱上進行分離後進入檢測器,檢測訊號由資料處理裝置採集與處理,並記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。

遇到複雜的混合物分離(極性範圍比較寬)還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程式升溫類似,不同的是氣相色譜改變溫度,

而hplc改變的是流動相極性,使樣品各組分在最佳條件下得以分離。

(二)高效液相色譜的分離過程  同其他色譜過程一樣,hplc也是溶質在固定相和流動相之間進行的一種連續多次交換過程。它借溶質在兩相間分配係數、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質得以分離。

開始樣品加在柱頭上,假設樣品中含有3個組分,a、b和c,隨流動相一起進入色譜柱,開始在固定相和流動相之間進行分配。分配係數小的組分a不易被固定相阻留,較早地流出色譜柱。分配係數大的組分c 在固定相上滯留時間長,較晚流出色譜柱。

組分b的分配係數介於a,c之間,第二個流出色譜柱。若一個含有多個組分的混合物進入系統,則混合物中各組分按其在兩相間分配係數的不同先後流出色譜柱,達到分離之目的。

不同組分在色譜過程中的分離情況,首先取決於各組分在兩相間的分配係數、吸附能力、親和力等是否有差異,這是熱力學平衡問題,也是分離的首要條件。其次,當不同組分在色譜柱中運動時,譜帶隨柱長展寬,分離情況與兩相之間的擴散係數、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動相的流速等有關。所以分離最終效果則是熱力學與動力學兩方面的綜合效益。

編輯本段高效液相色譜的型別(一)吸附色譜  在吸附色譜中,樣品的極性官能團牢固地保留在填料的吸附活性中心上,非極性烴基幾乎不予保留。所以,要清楚地辨別極性功能團的種類、數量和位置。通常,樣品能用吸附色譜分離的應是能溶解於有機溶劑並是非離子型的,強離子樣品是不適宜的。

吸附色譜所使用的流動相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作為基礎,按照樣品的極性加上乙醇,然而,最好是使所加入醇的濃度為10%或更少一些。如有可能,可進一步減小百分數。因為高濃度的醇會減少填料的吸附活性,減弱吸附能力,並使重現困難。

(二)分配色譜  1. 正相分配色譜

正相分配色譜適用於不溶於水而溶於有機溶劑且帶有極性基團的樣品,但正相分配色譜不適合於離子型物質。

2.反相分配色譜

這種方法目前應用非常廣泛,應用的範圍也很廣,在反相分配色譜中,樣品的非極性部分起保留作用。

通過使用的流動相是水—甲醇和水—乙腈,通過加入甲醇或乙腈的量的不同來調節分離,但如果樣品帶有離子型基團,需要在流動相中加入鹽或調節流動相的ph值,例如,如果樣品有一個—cooh 基團,使流動相的ph值是偏向酸性的,由於抑制了—cooh基團的電離而加強了保留。這個方法叫離子抑止法,如果樣品有強離子基,有時候採用在流動相中加入適當抗衡離子以形成離子對的離子對法。

在調節ph值中,保持ph值在填料說明書手冊中所規定的範圍內,大多數化學鍵式的二氧化矽使用在ph=2-9,然而,當加入鹽以後,最好使其ph=7.5-8或更小的,多孔聚合物填料能應用非常廣泛的ph值。

(三)離子交換色譜  這個方法是用填料的固定相的離子交換基團和樣品的離子基團之間的離子交換來分離樣品組分的,按照所交換的離子分成陽離子交換和陰離子交換。

離子交換色譜使用於能溶於水的離子型物質。在離子交換色譜中,流動相的鹽的濃度、ph及鹽的種類等都對保留值有很大的影響。在高效液相色譜的離子交換中所用的鹽有磷酸鹽、醋酸鹽和硼酸鹽。

因為氯化物會腐蝕不鏽鋼儀器,在高效液相色譜中不能使用naci或其他的氯化物鹽類。根據測量波長有些鹽也不能使用,例如,醋酸吸收大約在210nm,當檢測處在短波端的時候,用醋酸作流動相是不合適的。

(四)凝膠色譜  凝膠色譜不同於以上三種分離方法。凝膠色譜是根據分子大小用分子篩效應來分離樣品組分的。這個方法也叫排阻色譜或粒度排阻色譜。

具有一定孔徑的多孔性合成聚合物經常用作填料。

因為在樣品中,小尺寸的分子深深地滲透到微孔中,所以遲流出,而大尺寸的分子沒有滲透到微孔中,就很快流出。通常合成樹脂的分離使用有機溶劑作流動相,叫做凝膠滲透色譜。

凝膠色譜依樣品的性質又可分為凝膠滲透和凝膠過濾。

1.凝膠滲透色譜

凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography),簡稱gpc。此一類的色譜,使用於有機性溶媒的樣品中,如pvc,ps,abs等等,而所用的洗脫液有thf,chloroform等等。

2.凝膠過濾色譜

凝膠過濾色譜(gel filtrarion chromatography),簡稱gfc。此一種類的層析法,使用於水溶媒的試劑中,如蛋白質、澱粉及水性合成高分子等等,而所用的溶液有水、緩衝液等等。

凝膠的種類很多,按其原料**可分為有機膠和無機膠。按其製備的方法又可分為均勻、半均勻和非均勻三種凝膠。而根據凝膠的強度又可分為軟膠、半硬膠和硬膠三大類。

根據它對溶劑的適用範圍又可分為親水性、親油性和兩性凝膠等等。

編輯本段高效液相色譜法在分析檢測上的應用  食品中山梨酸、苯甲酸的測定

1. 原理  樣品加溫除去二氧化碳和乙醇,調ph至近中性,過濾後進高效液相色譜儀,經反相色譜分離後,根據保留時間和峰面積進行定性和定量。

2.試劑和溶液  方法中所用試劑,除另有規定外,均為分析試劑,水為蒸餾水或同等純度的水,溶液為水溶液。

(1)甲醇:優級純,如果是分析純,需重蒸。

(2)稀氨水:1+1 溶液,氨水加水等體積混勻。

(3)0.02mol/l乙酸鉸溶液:稱取1.54g乙酸按,加水至1000ml,溶解,經濾膜(0.45m)過濾。

(4)20g/l碳酸氫鈉溶液:稱取2g碳酸氫鈉(優級純)加水至100ml,振搖溶解。

(5)苯甲酸標準儲備液:準確稱取0.1000g 苯甲酸,加20g/l碳酸氫鈉溶液5ml,加熱溶解,移入100ml 容量瓶中,加水定客至100ml,搖勻,此溶液苯甲酸含量為1mg/1ml,作為儲備液。

(6)山梨酸標準儲備液:準確稱取0.1000g.

山梨酸,加碳酸氫鈉溶液(20g/l)5ml,加熱溶解,移入100ml 容量瓶中,加水定容至100ml,山梨酸含量為1mg/1ml,作為儲備溶液。

(7)苯甲酸、山梨酸標準混合使用溶液:取苯甲酸、山梨酸標準儲備溶液10.0ml,放入100ml容量瓶中,加水至刻度。

此溶液含苯甲酸、山梨酸各0.1mg/ml。經濾膜(0.

45m)過濾( 同時測定糖精鈉時,可加入糖精鈉標準儲備液)。

3.儀器  高效液相色譜儀(帶紫外檢測器)。

4.測定方法  (1)樣品處理

1.汽水、飲料、果汁類:( 汽水需微溫攪拌除去二氧化碳)吸取2.

0ml 樣品,加入已裝有中性氧化鋁(3cm*1.5cm)的小柱中,過濾,棄去初濾液,然後用流動相洗脫苯甲酸,接收於25ml帶塞量簡中,洗脫至刻度,搖勻。此液通過微孔濾膜後進樣。

3.配製酒類:稱取10.0g 樣品,放入小燒杯中,水浴加熱除去乙醇,用氨水(1+1)調節ph約7,加水定容至適當體積,經濾膜(0.45up)過濾。

(2)高效液相色譜參考條件

1.色譜柱:ywg-c18 4.6*150mm5up,或其他型號c18柱。

2.流動相:甲醇+乙酸鉸溶液(0.02mol/l)(5+95)。

3.流速:1.0ml/min。

4.進樣量:10ul。

5.檢測器  紫外檢測器,波長230mm,靈敏度0.2aufs。

2樓:好

1.電泳緩衝液的配製如下表所示

緩衝液tris

(mol/l)tricine

(mol/l)phsds

(%)陽極緩衝液

陰極緩衝液

膠緩衝液0.2

0.13.0—

0.1—8.9*

8.25**

8.4*—

0.10.3

* 用hcl調ph

** ph約為8.25

2.丙烯醯胺貯存液的配製

單丙-雙丙混合物單丙的百分數雙丙的百分數

49.5% t, 3%c

49.5% t, 6%c48

46.51.5

3.0t:丙烯醯胺的總濃度

c:交聯度

3.膠的製備,與一般sds-page相似,按下表配製分離膠和濃縮膠組 份分離膠

16% t,6%c濃縮膠

6% t,3%c

49.5% t, 3%c丙烯醯胺溶液(ml)49.5% t, 6%c 丙烯醯胺溶液(ml)膠緩衝液(ml)

脲(g)[甘油(ml)]

水(ml)

10%過硫酸銨(μl)

temed(μl)

總體積(ml)—

3.33.3

3.6[2.4]140

4.010.040.48

—1.00

—1.50

252.5

3.03

4.樣品緩衝液

4% sds

12%甘油

50mmol/l tris

2%巰基乙醇

0.01% serva blue

多肽樣品與樣品緩衝液混合沸煮2min(或40℃溫浴30min)。

5.將灌膠的玻璃板固定在電泳裝置上,用1%瓊脂糖封邊,倒入陰極緩衝液,依次加樣。

6.將電泳裝置放入電泳槽內,倒入陽極緩衝液,將正負極與電泳儀相接,恆電壓50~60v,待指示劑進入分離膠後,電壓可升至70~90v,恆壓約3h待指示劑走出凝膠下緣停止電泳。

7.染色、脫色及膠的儲存同sds-page